ProteanFect貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染攻略|LX2轉(zhuǎn)染操作protocol

   ProteanFect 轉(zhuǎn)染試劑盒是全·球首·款自組裝蛋白納米顆粒核酸轉(zhuǎn)染試劑，專為難轉(zhuǎn)細(xì)胞系設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)卓·越的外源基因遞送與表達(dá)。作為一種非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，ProteanFect可高效、低毒、簡(jiǎn)便地將基因遞送至細(xì)胞中，尤其適用于大片段和多片段基因遞送。LX2細(xì)胞是一種人類肝星狀細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，廣泛用于研究肝纖維化、肝損傷、肝臟疾病模型以及藥物篩選。LX2貼壁生長(zhǎng)，呈上皮細(xì)胞樣。本文將詳細(xì)介紹如何使用ProteanFect轉(zhuǎn)染試劑盒實(shí)現(xiàn)LX2細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。

LX2細(xì)胞的培養(yǎng)

生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分：DMEM培養(yǎng)基，含10% 胎牛血清和1%雙抗。

使用ProteanFect試劑盒轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞

1. 適合轉(zhuǎn)染的核酸類型：包括mRNA、siRNA和DNA。

2. 適合轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無血清DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。提前預(yù)熱或恢復(fù)至室溫。

3. 配置ProteanFect轉(zhuǎn)染體系：具體詳見表1-3。轉(zhuǎn)染體系在配置過程中出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象屬于正常。

4. 細(xì)胞準(zhǔn)備：確保細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，活率需超過90%。調(diào)整細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度時(shí)，避免反復(fù)離心，以免延長(zhǎng)處理時(shí)間，影響細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)染效率。

5. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對(duì)于貼壁細(xì)胞，可消化成細(xì)胞懸液進(jìn)行懸浮轉(zhuǎn)染，也可提前種板進(jìn)行貼壁轉(zhuǎn)染。具體詳見表1。孵育時(shí)間建議保持在45-60分鐘，延長(zhǎng)時(shí)間可能影響細(xì)胞活力。

6. 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活率檢測(cè)：使用陽性對(duì)照mRNA時(shí)，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察EGFP的表達(dá)。細(xì)胞活率可通過鏡下觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色或流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)，若細(xì)胞狀態(tài)良好，鏡下觀察可見細(xì)胞呈現(xiàn)抱團(tuán)生長(zhǎng)狀態(tài)。

a.ProteanFect轉(zhuǎn)染體系在配置過程中可能會(huì)出現(xiàn)一定的粘稠現(xiàn)象，屬于正常情況。

b.孵育時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)胞類型有所調(diào)整，建議孵育時(shí)間不超過2小時(shí)。

c.使用陽性對(duì)照mRNA時(shí)，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察到EGFP的表達(dá)。

a.建議mRNA濃度≥1 μg/μL。如需同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)mRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個(gè)mRNA時(shí)保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。

b.建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)siRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個(gè)siRNA時(shí)保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。

c.建議DNA濃度≥0.5 µg/µL；如需同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)DNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個(gè)DNA時(shí)保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的DNA總量不超過0.4 µg。同時(shí)，轉(zhuǎn)染效率受DNA質(zhì)量影響，建議使用無內(nèi)毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間。使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度，以提高轉(zhuǎn)染效果并降低細(xì)胞毒性。

使用ProteanFect試劑盒轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞實(shí)例

（1） 轉(zhuǎn)染步驟

（2） 結(jié)果分析

在轉(zhuǎn)染 EGFP mRNA或GFP pDNA后，可通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析。首先通過熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染后LX2細(xì)胞的EGFP蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)和活力進(jìn)行定性評(píng)估（圖 1）。同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)以定量分析其轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞收集完成后，離心棄去培養(yǎng)基，用1 × DPBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測(cè)（圖2，圖3）。

圖1. 利用ProteanFect貼壁轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的表達(dá)熒光圖。

圖2. 利用ProteanFect貼壁轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的表達(dá)流式分析圖。

圖3. 利用ProteanFect懸浮轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的表達(dá)流式分析圖。

常見問題

1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率

延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間，通常不超過2小時(shí)。

2. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染要求

轉(zhuǎn)染效率受DNA質(zhì)量影響。建議使用無內(nèi)毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間；使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度。

3. 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前處理

1）為獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，建議使用活性超過90%的細(xì)胞，可以通過臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活性。2）不建議使用傳代次數(shù)超過15次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3）新復(fù)蘇的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前需傳代2-3次，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)后使用。

4. 關(guān)于試劑盒中陽性對(duì)照的使用建議

首·次嘗試時(shí)，建議設(shè)置陽性對(duì)照組（EGFP mRNA和GFP pDNA），以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作和試劑的有效性。使用96孔板的細(xì)胞量即可，節(jié)省細(xì)胞和試劑。

5. 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)范圍

說明書中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，如細(xì)胞較大，可根據(jù)細(xì)胞大小降低細(xì)胞數(shù)以匹配相應(yīng)培養(yǎng)皿。如果細(xì)胞數(shù)量較少，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以96孔板為例，建議細(xì)胞數(shù)量不低于4×103/孔，以確保后續(xù)檢測(cè)的可靠性。

6. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)與活力

轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染后第二天，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)基本恢復(fù)。

7. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞離心后看不到沉淀

對(duì)于小體積轉(zhuǎn)染體系（如96孔板），離心后細(xì)胞沉淀不明顯是正常現(xiàn)象。細(xì)胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細(xì)胞損失，離心后移液時(shí)應(yīng)避免槍頭緊貼底部。

8. 轉(zhuǎn)染體系擴(kuò)大是否影響轉(zhuǎn)染效率

如轉(zhuǎn)染細(xì)胞量較大，推薦使用離心管進(jìn)行孵育，轉(zhuǎn)染體系參照表3，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

ProteanFect試劑盒類型及適用細(xì)胞系

現(xiàn)有的六款轉(zhuǎn)染試劑盒：

1. PT01--ProteanFect 轉(zhuǎn)染試劑盒

2. PT02--ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑盒

3. PT03--ProteanFect Max小鼠原代免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒

4. PT04--ProteanFect CRISPR Cas9基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒

5. PT05--ProteanFect CRISPRMax Cas9基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒

6. PT06-ProteanFect CRISPRMax Cas9小鼠原代免疫細(xì)胞基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒

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