ACD RNAscope技術介紹及應用

RNAscope® 由美國Bio-Techne旗下ACD公司于2012 年推出，是一項新型的RNA原位雜交技術。它是基于ACD專·利的雙zz型探針設計，寡核苷酸互補配對的信號放大系統，通過酶催化底物，可在顯微鏡下看到熒光或可見光的信號。不僅實現了單一分子RNA的原位檢測，還可實現在一張組織切片上標記多個不同的RNA分。根據試劑盒的不同，分為熒光試劑盒和可見光試劑盒。該技術可以應用到多種類型的樣本中，如石蠟包埋樣本，冰凍樣本，貼壁細胞，懸浮細胞樣本等。

RNAscope®技術原理

RNAscope® 獨·特的雙Z (ZZ)探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。一個標準探針是由20對雙Z探針組成，每個Z靶向探針由三部分組成：Z型探針底部是一個18到25堿基長度的序列能夠互補結合到目標RNA上。這個序列是基于目標序列的不同，以及獨·特的結合特征而進行的特異性設計。Z型探針的中部是一個間隔序列，鏈接了探針的上下兩端。Z型探針的頂端是一個14堿基長度的尾部序列。因而一對Z形探針對的頂端序列組合成一段28個堿基長度的結合區以供信號放大前體序列的結合。

RNAscope®技術的優勢

特異性：Z形探針對的設計屏蔽了背景噪音。單獨·一個Z形探針對即使結合上非目標序列也無法提供信號放大前體序列結合所需要的足夠長度，從而防止了對于非特異信號的擴增，保障了特異性；

靈敏度：每三對Z形探針對就足以實現對一個RNA分子的檢測。在RNA分子出現部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下，20對Z形探針對的設計保障了足夠強勁有效的檢測RNA ；

提供qPCR無法提供的原位信息、形態信息；

單分子量級的可視性與量化分析：此20x20x20x的引物設計與信號放大原理讓單一RNA分子能夠在標準的顯微鏡下以一個點狀信號的方式可視化呈現；

能夠探測到降解的RNA ：得益于其相對短小的目標結合區域(Z形探針對的底端40到50個堿基長度)，此Z形探針對的設計為檢測到部分降解的RNA提供了保障；

同時檢測多個靶點：可見光雙靶點RNA的檢測、 3個靶點RNA的熒光檢測及RNA和蛋白分子的同步檢測。

RNAscope®操作步驟

Step 1透化：通過RNAscope®預處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細胞，以暴露目標RNA。

Step 2雜交：RNAscope®針對靶基因設計的20對Z型目標探針與目標RNA雜交。

Step 3信號放大：RNAscope®檢測試劑盒通過信號擴增序列與顯色標記有序互補結合，從而擴大信號。

Step 4可視信號形成：在透視光學顯微鏡或者多光譜成像系統的觀測下，每一個目標RNA分子以一個點狀信號的形式呈現。

Step 5量化分析：顯微鏡下，直接計數或者使用HALO自動化圖像分析軟件，對每一個細胞中的RNA單分子信號進行精確定量分析。

RNAscope®結果分析

顯微鏡觀察結果并分析

根據每個細胞中觀察到的點狀信號評分（定量），評分標準如下圖所示：

RNAscope®檢測應用

1、腫瘤相關靶標檢測

由于全基因組基因表達譜技術的廣泛使用，RNA生物標志物或基因表達特征已成為一類主要的癌癥生物標志物。目前臨床診斷分析中使用的平臺是實時RT-PCR，這種方法有一個嚴重的缺點:RNA提取的過程破壞了基因表達測量的組織背景，使得不可能將觀察到的信號映射到單個細胞。此外，這些檢測容易受到意想不到的細胞類型(如非癌細胞)和不想要的組織成分(如纖維化和壞死)的干擾。相比之下， RNAscope®允許將分子信息與組織病理學相結合，以獲得最佳的臨床解釋。

RNAscope檢測FFPE腫瘤組織中RNA。A:原發腫瘤組織(乳腺、肺和前列腺)的顯色染色(DAB)，與泛素C (UBC)探針或細菌基因dapB探針雜交作為陰性對照。細胞核用蘇木精反染。B: FFPE樣品中低拷貝轉錄物的熒光檢測。乳腺腫瘤組織切片用無探針或Alexa Fluor 488標記探針組(綠色)與HPRT1或POLR2A雜交。細胞核用DAPI反染(藍色)。[1]

2、分泌型蛋白的檢測

一些分泌蛋白，如生長因子、細胞因子等，這些蛋白的IHC檢測可能存在缺乏公·認的有效的抗體，蛋白結果難以判讀等問題，通過RNAscope檢測其mRNA的表達可能更易得到有效的檢測結果。

3、點突變、可變剪切的檢測

對于點突變、可變剪切以及高度同源序列翻譯產物的檢測，因無法生成有效抗體從而無法在蛋白水平進行原位檢測，通過RNAscope來可視化定位是很好的替代方法。

4、RNAscope®檢測其他應用

腫瘤生物標志物、腫瘤微環境檢測；

免疫與免疫治療、免疫微環境檢測；

神經研究領域Marker、GRCR、神經激活與可塑性研究等；

病毒、病毒與宿主相互作用，如HPV、HIV、AAV、溶瘤病毒等；

干細胞標記與干細胞微環境；

基因治療、CART安全性評估、TCR-Tcell等多種細胞治療；