人外周血TH1/TH2/TH17流式抗體配色方案

人外周血TH1/TH2/TH17染色

注意：采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管，刺激劑盡量選用凍干粉自己配置；cocktail刺激劑是液體形式，PMA會因保存不當導致活性降低，影響刺激效果，而凍干粉形式的PMA較穩定，可以保證刺激效果。

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測方法

細胞刺激步驟：（刺激體系1ml）

取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內，加入800 ml的*培養基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養箱培養刺激0.5小時后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細胞，放入CO2培養箱培養刺激3.5小時。

流式檢測步驟：

1、收集細胞于流式管內，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；

2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋），旋渦混勻,現配現用；

3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟 失），彈散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時加入相應的細胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；

7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細胞，并上機檢測并分析。

注意：1、根據實驗需求選擇相應的抗體，并做單染管用于調節補償（具體如何設置單染管，可參照Biogems流式手冊補償章節介紹）。

     2、盡量做同型對照，因細胞因子表達量不高（尤其是IL-4表達量非常低），細胞因子抗體對應的同型對照一般都要做。

     3、PMA刺激會導致人T細胞表面CD4表達的下調，PMA與Lonomycin聯合刺激下調非常明顯，4h刺激后會下調50%以上，6h刺激幾乎檢測不到CD4，因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細胞。

     4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對細胞損傷較大，建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液，在加入破膜劑，這樣會減少對細胞的損傷（形成的細胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結果

注意：細胞破膜后對形態影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌，優勢是基于優異品質的較低價位，現正進行一系列*活動。

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