關于細胞凍存液應用技術的分析

細胞凍存液是細胞凍存時必須的一種溶液，長期以來大量國內外生物細胞學術相關書籍介紹的常規凍存液配方和我們長期所使用的凍存液各組分體積百分比均為細胞培養液70 80%，牛血清10 30%，二甲基亞砜10%。常規使用的培養液如MEM、M199、 Eagle和DMEM等均已市場商品化。凍存液的作用是使細胞均勻地分散在溶液中，給細胞一個均勻分布的環境和空間，同時供給細胞生命代謝所必須的營養物質，防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷。在長期的生物學實驗中，廣泛使用上述配方凍存細胞。大量的實際生物細胞學實驗和大量統計數據表明，采用這種凍存液所凍存的細胞復蘇后存活率一般在50 70%，成活率比較低。凍存細胞經過復蘇，培養12小時后在普通光學顯微鏡下觀察，存活率一般在60%左右；當存活率小于50%時，細胞生長繁殖緩慢，形態不規則，細胞比較細小，長勢比較差，基本上不能存活；當細胞存活率在60%左右時，細胞分布比較均勻，活細胞比較多，形態比較正常，長滿單層需要6 8天。目前采用的細胞凍存液的凍存過程與復蘇效果常規細胞凍存液包括以下體積百分比的各組分細胞培養液70%，小牛血清20%，二甲基亞砜10%。以上各組分混勻即成。細胞凍存過程培養生長成單層的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細胞一瓶，其細胞密度約6X IOVcm2、培養面積為225cm2，0. 25%的胰酶消化2分鐘，棄掉胰酶，加入培養液10ml，吹打混勻細胞懸液，離心1500轉/10分鐘，棄上清，加入常規的凍存液20ml混勻， 2ml/管分裝入潔凈的凍存管；將該凍存管置于2 8°C 2小時，-20°C 2小時，_80°C過夜， 然后浸入液氮中長期保存。細胞復蘇過程從液氮中取出凍存的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細胞一管 (2ml/管)，置入37°C水浴溶解，離心1500轉/10分鐘，棄掉上清，加入20 %小牛血清培養液10ml，置37°C培養；培養12小時候后觀察，可見有60%左右的細胞貼壁；未長成單層細胞，更換10%的小牛血清培養液繼續培養，6 8長滿單層細胞后傳代培養。在生物技術飛速發展的今天，人們在生物技術學及其相關科學的研究中，越來越多的運用組織細胞培養繁殖技術，將有研究意義或有應用前景的組織細胞采用低溫度進行長期的保存，一旦有需要，可以隨時對所的細胞進行復蘇，恢復其完整的形態結構與生物學特征，供生命科學研究使用，細胞凍存和復蘇的效果是直接影響細胞增殖成功與否的的關鍵技術。 

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